Im historischen Weinkeller kann man in die Geschichte des Weinbaus im Markgräflerland eintauchen. Einen wichtigen Stellenwert nimmt der in Müllheim geborene Weinbaupionier Adolph Blankenhorn (1843-1906) ein, erster Önologie-Professor in Deutschland und Gründer des Deutschen Weinbauverbandes. Das Erdgeschoss informiert, teilweise mit interaktiven Stationen, über die abwechslungsreiche Geologie und über wichtige archäologische Funde der Region von der Ur- und Frühgeschichte über die Römerzeit bis ins Mittelalter. Im ersten Obergeschoss befindet sich eine umfangreiche Galerie zur Kunst am südlichen Oberrhein mit Werken der klassischen Moderne (Badische Secession) und namhafter zeitgenössischer Künstler. Im Dachgeschoss ist eine moderne, erlebnisorientierte Abteilung zur Regionalgeschichte des Markgräflerlandes als Grenzregion zu Frankreich, zur Schweiz und zeitweise auch zum habsburgischen Vorderösterreich entstanden, die durch eine Literaturausstellung in Kooperation mit dem Deutschen Literaturarchiv Marbach ergänzt wird.
Das Museum versteht sich als lebendige, offene Kulturinstitution im Dreiländereck. Ein Zweigmuseum ist das 2008 eröffnete Mühlenmuseum in der alten Frick-Mühle Müllheim.
